九龙六合图库彩图
概述
货号: A2391
宿主: Rabbit
同?#20013;? IgG
ABclonal:Western blot - Pan Acetyl-Lysine pAb (A2391)
优惠价
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背景

免疫原信息

免疫原A synthetic peptide corresponding to a sequence containing acetylated K.
序列Email for sequence
基因ID
Swiss Prot
别名

应用

?#20174;?#29289;种ALL
验证应用WBIHCICCIFIPChIPChIPseqRIPFCELISAMeDIPNucleotide Array
用户验证的应用

unknown (unknown)

WB (Mouse)

推荐稀释比&实验步骤
  • WB   1:500 - 1:1000  [ 实验步骤 ]

    蛋白质印迹法标准操作流程

    一、实验试剂及耗材

    1、样品制备试剂
    • a. RIPA 裂解液
    • b. 蛋白酶抑制剂
    • c. BCA工作液
    • d. BSA Standard Solution(5mg/ml)(RM00005)
    • e. 1×PBS缓冲液(RM00012)
    • d. 5×loading buffer(RM00001)
    2、制胶试剂
    • a.30% Acr-Bis (29:1)(RM00006)
    • b.1 M Tris-HCl (pH6.8)(RM00003)
    • C.1.5M Tris-HCl (pH8.8)(RM00002)
    • d.10%SDS(RM00004)
    • e.10%Ammonium persulfate (APS)(RM00007)
    • f.TEMED(RM00009)
    3、电泳、转膜试剂及耗材
    • a. 1X Tris-Glycine SDS Running Buffer(RM00010)
    • b. 1X Western Transfer Buffer(RM00011)
    • c. Filter Paper (7.5×10cm)(RM00019)
    • d. Nitrocellulose membrane(RM00017/ RM02801/ RM00018)
    4、封闭、一抗二抗孵育及曝光试剂
    • a. 1XTBST Buffer(RM00013)
    • b. 1X Western Blocking Buffer(RM00015)
    • c. Skimmed milk powder(RM00014)
    • d. Bovine Serum Albumin (BSA)(RM02802)
    • e. Western Antibody Dilution Buffer(RM00016)
    • f. HRP ?#21058;?#20108;抗(AS014/AS003)
    • g. SignalFire? ECL Reagent(RM00020/RM00021)

    二、实验步骤

    1、样品制备

    (1)细胞收集

    • a. 贴壁培养细胞收集
      去除贴壁细胞的培养液,用PBS、NS或无血清培养基清洗1次,低速离心,弃上清,留取沉淀。
    • b. 悬浮培养细胞收集
      速离心悬浮细胞,弃上清,收集沉淀。?#31181;?#36731;弹细胞,使其松散。
    • c. 组织样本收集
      把组织剪切成细小的碎片,越小?#33014;謾?#21462;液氮或超低温冰箱中冷冻30min以?#31995;?#32452;织,?#26438;?#29992;液氮研磨,研磨过程尽量控制在1~2min之内,以减少蛋白的降解。

    (2)总蛋白提取

    • a. 细胞/组织裂解
      将装有细胞沉淀或组织碎片的容器完全插入冰中。细胞沉淀按照1mL裂解液/107个细胞(1个T75培养瓶细胞量)的比例加入相应体积的裂解液(细胞量足够时?#25216;?#20837;3mL,不足?#22791;?#25454;细胞量计算),裂解20min,每隔5min将离心管置于?#34892;?#25391;荡仪上震荡10s。组织碎片按照0.5mL 裂解液/100mg组织向匀浆器中加入蛋白裂解液,每3min研磨一次,重复5次,使组织尽量碾碎。(裂解液中根据需要选择添加或不添加蛋白酶抑制剂)。
    • b. 离心
      把裂解好的样品配平后,置于预冷的高速冷冻离心机中,12000 rpm,15min。
    • c. 蛋白变性
      完成离心后,上清即为蛋白提取液。吸取少量蛋白提取液做蛋白浓度测定。向剩余的蛋白提取液的离心管中加入1/4上清体积的5×Loading Buffer(最终工作液为1X),待干式恒温器温度升至95℃后,将1.5mL离心管插入加热孔中,95℃加热变性10min,待液体完全冷却后置于-20℃保存。

    (3)蛋白浓度测定(BCA法)

    • a. BCA工作液的配置
      根据样品数量,按50体积BCA试剂A加入1体积BCA试剂B(50:1)配置适量BCA工作液,充分混?#21462;CA工作液室温24h内稳定。
    • b. 标准品测定
      取10μl蛋白标准品(5mg/ml BSA)稀释至50μl,使终浓度为1mg/ml。稀释后的蛋白标准品可以-20℃长期保存。此标准品溶液的稀释液可使用去离子水或1*PBS。将标准品按0、1、2、4、8、12、16、20μl加入到96?#35013;?#20013;,加稀释液补足到20μl(见附表)。加?#23454;?#20307;积样品到96?#35013;?#30340;样品孔中,如果样本不足20μl,需加稀释液补足到20μl。请注意记录样品体积。各孔加入200μl BCA工作液,37℃放置20-30min。用酶标仪测定A562,或540-595nm之间的其他波长吸光?#21462;?#26681;据标准曲线和使用的样品体积计算出样品的蛋白浓?#21462;?/li>
    2、凝胶电泳

    (1)制胶器安装

    • 根据使用?#24471;?#20070;安装。

    (2)分离胶制备

    • 根据不同蛋白大小,选择不同浓度的分离胶(见附件表)。将制备好的胶溶液注入预先安装好的制胶器中,加入异丙醇封胶。室温水平放置30min左右。注意防止胶溶液产生气泡并注入制胶器中;注胶前再加入TEMED,防止注胶前凝固;注入异丙醇时需沿玻板一边缓慢拖动加入。

    (3)浓度胶制备

    • 分离?#32791;?#22266;后,沿玻板一边倒出异丙?#36857;?#24182;用滤纸吸干。再根据需要的体积制备浓度胶(见附表)。将制备好的胶溶液注入制胶器中,并把准备好的样品梳沿玻板一端缓慢插入胶溶液中,室温水平放置20-30min。注意样品梳与胶溶液之间避免气泡产生。

    (4)上样

    • 待浓缩?#32791;?#22266;好后,双手垂直拔出样品梳,并用Tris-Glycine SDS Running Buffer注入到内外槽中,形成闭合回路。用移液器吸取样品垂直梳孔上样,蛋白含量25ug/孔。注意内槽Tris-Glycine SDS Running Buffer需注满,外槽Tris-Glycine SDS Running Buffer没过底部3~5cm?#32431;傘?/li>

    (5)电泳

    • 上样完以后,连通电泳仪电源,注意正负极需连接正确,设定适宜的电泳参数,浓缩胶电泳参数为恒压80V,待样本进入分离胶时,可将电泳调至120V。?#21464;?#37210;蓝电泳到凝胶底部时,停止电泳,关闭电泳仪电源。
    3、转膜

    (1)准备工作

    • a. 转膜缓冲液至少提前2h (即开始电泳后)放入-20℃冰箱预冷。
    • b. 根据胶体大小选择,将Filter Paper及Nitrocellulose membrane剪裁至合适尺寸。
    • c. 目的蛋白>20KD选择0.45μm NC膜;目的蛋白<20KD选择0.2μm的NC膜或0.22μm的PVDF膜,选择完毕后将NC膜放在Western Transfer Buffer中浸泡备用,注意如使用的是PVDF膜需先放入?#29366;?#20013;浸泡5-10min,再放入Western Transfer Buffer中浸泡备用。

    (2)转膜

    • 取出玻板中的凝胶,在夹板上依次放一块多孔垫、三张滤纸、凝胶、NC膜、三张滤纸、一块多孔垫(“三明治”结构),将转好的膜放在转膜槽,按一定的条件进行转膜。(见附表)
    4、封闭
    • 将膜从“三明治”结构中取出,放入合?#23454;?#25239;体孵育槽中,加入Western Blocking Buffer室温孵育1h,一张6.3×8.3cm大小的膜加入6~7ml?#32431;傘?/li>
    5、一抗孵育
    • a. 将一抗用Western Antibody Dilution Buffer按照合适比例进行稀释。
    • b. 封闭结束后,将稀释好的一抗工作液倒入孵育槽中,室温2h或4℃过夜。
    6、洗涤
    • 一抗孵育结束后,加入TBST Buffer洗涤4次,5min/次。
    7、二抗孵育
    • a. 一抗洗涤结束前10min,将二抗用Western Antibody Dilution Buffer按照合适比例进行稀释。
    • b. 洗涤结束后,将稀释好的二抗工作液加入孵育槽中,室温1h。
    8、洗涤
    • 二抗孵育结束后,加入TBST Buffer洗涤4次,5min/次。
    9、曝光
    • a. 根据膜的大小,按每 10cm2 膜使用 1-2ml 工作液,按比例吸取等体积的 SolutionⅠ和 SolutionⅡ混匀,配制成发光检测工作液。
    • b. 用平头镊子将膜取出,膜的下?#30331;?#36731;接触吸水纸,去除膜上多余的液体。用移液器将工作液加到转印膜上,使其均有?#21754;牽?#23460;温孵育 1-2min,此步骤可在洁净保鲜膜上或塑料盒中完成。
    • c. 压片检测:将膜固定于片?#24515;凇?#26263;室内压片 1 分钟,立即显影定影,根据结果再调整压片时间。或直接分别压片 30 秒、1、3、 5 分钟,?#32531;?#19968;起显影定影观察结果。
    • d. 荧光成像仪检测:将膜放置?#25509;?#20809;成像仪内,参考仪器?#24471;?#20070;进行检测。

    附表1:BSA标准品稀释

    1mg/ml BSA(μl)稀释液(μl)对应的蛋白含量(mg/ml)
    0200
    1190.05
    2180.1
    4160.2
    8120.4
    1280.6
    1640.8
    2001

    附表2:分离?#21495;?#24230;的选择

    分子量(kDa)分离?#21495;?#24230;
    X≤1015%
    10<X≤1513.5%
    15<X≤2512%
    25<X≤3511%
    35<X≤4010%
    40<X≤559%
    55<X≤708%
    70<X≤1007%
    100<X6%
    备注:X为目的蛋白大小

    附表3:分离?#21495;?#21046;

    分离?#21495;?#24230;6%7%8%9%10%11%12%13.5%15%
    去离子水(mL)5.34.94.64.34.03.653.32.82.3
    30%丙烯酰胺 (mL)22.42.73.03.33.654.04.55.0
    1.5M Tris-HCL(pH8.8) (mL)2.5
    10%SDS(mL)0.1
    10%AP(mL)0.1
    TEMED(mL)0.01
    总体积(mL)10

    附表4?#21495;?#32553;?#21495;?#21046;

    5%浓缩胶5%浓缩胶5%浓缩胶5%浓缩胶5%浓缩胶
    去离子水(mL)1.12.12.73.44.1
    30%丙烯酰胺 (mL)0.330.50.670.831.0
    1.0M Tris-HCL(pH6.8) (mL)0.250.380.50.630.75
    10%SDS(mL)0.020.030.040.050.06
    10%AP(mL)0.020.030.040.050.06
    TEMED(mL)0.0020.0030.0040.0050.006
    总体积(mL)23456

    附表5:转膜条件选择

    分子量(kDa)分离?#21495;?#24230;
    X≤10恒流200mA,30min
    10 < X≤15恒流200mA,40min
    15< X≤20恒流200mA,50min
    20< X≤50恒流200mA, 1kDa/min+20min
    50< X≤100恒流200mA, 1kDa/min+30min
    100< X≤150恒流250mA, 1kDa/min+20min
    150< X≤180恒流270mA, 1kDa/min(时间控制在3h内)
    180< X恒流270mA, 1kDa/min(时间控制在4h内)
    备注:X为目的蛋白大小
  • IP   1:20 - 1:50  [ 实验步骤 ]

    IP检测

    一、实验试剂

    • (1)rProtein A/G Plus MagPoly Beads(RM09008)
    • (2)裂解液&洗杂液:Cell lysis buffer for IP (without inhibitors)(RM00022)
    • (3)蛋白酶抑制剂
    • (4)封闭液?#27721;?3% BSA 的 1X PBS
    • (5)1×PBS 缓冲液(RM00012)
    • (6)5×loding buffer(RM00001)(使用时用去离子水稀释至工作浓度?#32431;桑?/li>
    • (7)Control IgG (AC005/ AC011/AC034)

    二、实验步骤

    1、样本处理

    (1)贴壁培养细胞

    • a. 取裂解液室温溶解混匀,根据需要选择添加或不添加蛋白酶抑制剂。
    • b. 去除贴壁细胞的培养液,用PBS、NS或无血清培养基清洗1次,低速离心,弃上清,留取沉淀。
    • c. 按照6?#35013;?#27599;孔加入100~200μl裂解液的比例,加入裂解液。移液器轻轻?#33633;潁?#20351;裂解?#27721;?#32454;胞充分接触。通常裂解液作用于细胞1~5s内,细胞会被裂解。
    • d. 1000~12000g,离心3~5min(如果用冷冻离心机4℃效果更佳),取上清。

    (2)悬浮培养细胞

    • a. 取裂解液室温溶解混匀,根据需要选择添加或不添加蛋白酶抑制剂。
    • b. 速离心悬浮细胞,弃上清,收集沉淀。
    • c. ?#31181;?#36731;弹细胞,使其松散。按照6?#35013;?#27599;孔加入100~200μl裂解液的比例,加入NP-40裂解液。通常6?#35013;?#27599;孔加入100~200μl裂解液已经足够,但如果细胞密度非常高可以?#23454;?#21152;大裂解液的用量150~200μl,再用?#31181;?#36731;弹以充分裂解细胞。充分裂解后应无明显沉淀。
    • d. 1000~12000g,离心3~5min(如果用冷冻离心机4℃效果更佳),取上清。

    (3)组织样本

    • a. 取裂解液室温溶解混匀,根据需要选择添加或不添加蛋白酶抑制剂。
    • b. 把组织剪切成细小的碎片,越小?#33014;謾?/li>
    • c. 取液氮或超低温冰箱中冷冻30min以?#31995;?#32452;织,?#26438;?#29992;液氮研磨,研磨过程尽量控制在1~2min之内,以减少蛋白的降解。
    • d. 按照每20mg组织加入100~200μl裂解液的比例,加入含有PMSF的裂解液。冰上或4℃裂解30-60min。(步骤3、4也可采用以下过程:按照每20mg组织加入100~200μl裂解液的比例加入NP-40裂解液。用玻璃匀浆器或组织研磨器匀浆,直至充分裂解,过程尽量控制在1~2min之内,以减少蛋白的降解。)
    • e. 按照每20mg组织加入100~200μl裂解液的比例,加入裂解液。
    • f. 1000~12000g,4℃离心10~15min(如无低温离心机,室温下离心也可),取上清。
    2、磁珠预处理
    • (1)将rProtein A/G Plus MaqPoly Beads颠倒或漩涡混匀,翻转?#21487;?#21457;现底部无黑色沉淀?#32431;傘?/li>
    • (2)取30μl rProtein A/G Plus MaqPoly Beads?#21015;?#30340;EP管中,放在磁分离器上,待溶液澄清后,用移液器吸弃保护液。
    • (3)将EP管从磁分离器上取下来,加入1ml Cell lysis buffer for IP (without inhibitors),混匀,放置在磁分离器上,收集磁珠,用移液器吸弃洗杂液,重复2次。
    • (4)将EP管从磁分离器上取下来,加入1mL的3% BSA,置于翻转混合仪4℃封闭1h.
    • (5)重复步骤3),备用。
    3、磁珠、抗原-抗体复合物结合
    • (1)将含有抗原的样品(通常300μl-1000μl,抗原量200μg)中加入目标抗体(通常3μg),置于翻转混合仪4℃?#36335;从?h或过夜。
    • (2)将上述完成抗体-抗原结合的复合物与备用好的磁珠进行混合,置于4℃?#36335;从?h或过夜。
    • (3)将上述磁珠-抗体-抗原复合物放在磁分离器上进行分离,收集上清液,以备后续检测。
    • (4)向离心管中加入1ml洗杂液,用移液器轻轻?#33633;?#20351;磁珠-抗体-抗原复合物均匀分散,?#32531;?#36827;行磁性分离,弃上清液;从磁分离器上取下离心管,重复洗涤两次。
    4、抗原洗脱

    (1)变性洗脱(此方法洗脱的样品适用于SDS-PAGE检测。)

    • a. 从磁分离器上取下离心管,向其中加入30μl 2X SDS-PAGE Loading Buffer混合均匀,95℃加热15min。
    • b. 置于磁性分离器上进行磁性分离,收集上清液进行SDS-PAGE检测。

    (2)非变性洗脱

    • a. 向磁珠-抗体-抗原复合物中加入50μl洗脱液,混合均匀,室温孵育5min。
    • b. 置于磁性分离器上进行磁性分离,收集洗脱液?#21015;?#30340;EP管中。
    • c. 重复步骤1)和2),收集洗脱液,与2)中洗脱液混合,加入中和液中和至pH7.0-8.0。用于后期功能分析。
理论分子量
实际分子量Refer to Figures
存储缓冲液Store at -20℃. Avoid freeze / thaw cycles.
Buffer: PBS with 0.02% sodium azide,50% glycerol,pH7.3.
实验方法Western blotting    
阳性样本HeLa
细胞定位
纯化方式Affinity purification

Pan Acetyl-Lysine pAb 检测图片

ABclonal:Western blot - Pan Acetyl-Lysine pAb (A2391) }

Western blot - Pan Acetyl-Lysine pAb (A2391)

Western blot analysis of extracts of HeLa cells, using Pan Acetyl-Lysine antibody (A2391).
Secondary antibody: HRP Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) (AS014) at 1:10000 dilution.
Lysates/proteins: 25ug per lane.
Blocking buffer: 3% nonfat dry milk in TBST.

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