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Acetyl-Histone H4-K8 pAb

概述
货号: A7258
宿主: Rabbit
同?#20013;? IgG
ABclonal:Western blot - Acetyl-Histone H4-K8 pAb (A7258)
ABclonal:Immunohistochemistry - Acetyl-Histone H4-K8 pAb (A7258)
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ABclonal:Immunofluorescence - Acetyl-Histone H4-K8 pAb (A7258)
ABclonal:Chromatin Immunoprecipitation - Acetyl-Histone H4-K8 pAb (A7258)
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背景

Histones are basic nuclear proteins that are responsible for the nucleosome structure of the chromosomal fiber in eukaryotes. This structure consists of approximately 146 bp of DNA wrapped around a nucleosome, an octamer composed of pairs of each of the four core histones (H2A, H2B, H3, and H4). The chromatin fiber is further compacted through the interaction of a linker histone, H1, with the DNA between the nucleosomes to form higher order chromatin structures. This gene is intronless and encodes a replication-dependent histone that is a member of the histone H4 family. Transcripts from this gene lack polyA tails; instead, they contain a palindromic termination element. This gene is found in a histone cluster on chromosome 1. This gene is one of four histone genes in the cluster that are duplicated; this record represents the centromeric copy.

免疫原信息

免疫原A synthetic peptide of human Acetyl-Histone H4-K8
序列Email for sequence
基因ID8370
Swiss ProtP62805
别名HIST2H4A; FO108; H4; H4/n; H4F2; H4FN; HIST2H4; histone H4

应用

?#20174;?#29289;种Human, Mouse, Rat
验证应用WBIHCICCIFIPChIPChIPseqRIPFCELISAMeDIPNucleotide Array
用户验证的应用

WB (Mouse)

推荐稀释比&实验步骤
  • WB   1:1000 - 1:3000  [ 实验步骤 ]

    蛋白质印迹法标准操作流程

    一、实验试剂及耗材

    1、样品制备试剂
    • a. RIPA 裂解液
    • b. 蛋白酶抑制剂
    • c. BCA工作液
    • d. BSA Standard Solution(5mg/ml)(RM00005)
    • e. 1×PBS缓冲液(RM00012)
    • d. 5×loading buffer(RM00001)
    2、制胶试剂
    • a.30% Acr-Bis (29:1)(RM00006)
    • b.1 M Tris-HCl (pH6.8)(RM00003)
    • C.1.5M Tris-HCl (pH8.8)(RM00002)
    • d.10%SDS(RM00004)
    • e.10%Ammonium persulfate (APS)(RM00007)
    • f.TEMED(RM00009)
    3、电泳、转膜试剂及耗材
    • a. 1X Tris-Glycine SDS Running Buffer(RM00010)
    • b. 1X Western Transfer Buffer(RM00011)
    • c. Filter Paper (7.5×10cm)(RM00019)
    • d. Nitrocellulose membrane(RM00017/ RM02801/ RM00018)
    4、封闭、一抗二抗孵育及曝光试剂
    • a. 1XTBST Buffer(RM00013)
    • b. 1X Western Blocking Buffer(RM00015)
    • c. Skimmed milk powder(RM00014)
    • d. Bovine Serum Albumin (BSA)(RM02802)
    • e. Western Antibody Dilution Buffer(RM00016)
    • f. HRP ?#21058;?#20108;抗(AS014/AS003)
    • g. SignalFire? ECL Reagent(RM00020/RM00021)

    二、实验步骤

    1、样品制备

    (1)细胞收集

    • a. 贴壁培养细胞收集
      去除贴壁细胞的培养液,用PBS、NS或无血清培养基清洗1次,低速离心,弃上清,留取沉淀。
    • b. 悬浮培养细胞收集
      速离心悬浮细胞,弃上清,收集沉淀。?#31181;?#36731;弹细胞,使其松散。
    • c. 组织样本收集
      把组织剪切成细小的碎片,越小?#33014;謾?#21462;液氮或超低温冰箱中冷冻30min以?#31995;?#32452;织,?#26438;?#29992;液氮研磨,研磨过程尽量控制在1~2min之内,以减少蛋白的降解。

    (2)总蛋白提取

    • a. 细胞/组织裂解
      将装有细胞沉淀或组织碎片的容器完全插入冰中。细胞沉淀按照1mL裂解液/107个细胞(1个T75培养瓶细胞量)的比例加入相应体积的裂解液(细胞量足够时?#25216;?#20837;3mL,不足?#22791;?#25454;细胞量计算),裂解20min,每隔5min将离心管置于?#34892;?#25391;荡仪上震荡10s。组织碎片按照0.5mL 裂解液/100mg组织向匀浆器中加入蛋白裂解液,每3min研磨一次,重复5次,使组织尽量碾碎。(裂解液中根据需要选择添加或不添加蛋白酶抑制剂)。
    • b. 离心
      把裂解好的样品配平后,置于预冷的高速冷冻离心机中,12000 rpm,15min。
    • c. 蛋白变性
      完成离心后,上清即为蛋白提取液。吸取少量蛋白提取液做蛋白浓度测定。向剩余的蛋白提取液的离心管中加入1/4上清体积的5×Loading Buffer(最终工作液为1X),待干式恒温器温度升至95℃后,将1.5mL离心管插入加热孔中,95℃加热变性10min,待液体完全冷却后置于-20℃保存。

    (3)蛋白浓度测定(BCA法)

    • a. BCA工作液的配置
      根据样品数量,按50体积BCA试剂A加入1体积BCA试剂B(50:1)配置适量BCA工作液,充分混?#21462;CA工作液室温24h内稳定。
    • b. 标准品测定
      取10μl蛋白标准品(5mg/ml BSA)稀释至50μl,使终浓度为1mg/ml。稀释后的蛋白标准品可以-20℃长期保存。此标准品溶液的稀释液可使用去离子水或1*PBS。将标准品按0、1、2、4、8、12、16、20μl加入到96?#35013;?#20013;,加稀释液补足到20μl(见附表)。加?#23454;?#20307;积样品到96?#35013;?#30340;样品孔中,如果样本不足20μl,需加稀释液补足到20μl。请注意记录样品体积。各孔加入200μl BCA工作液,37℃放置20-30min。用酶标仪测定A562,或540-595nm之间的其他波长吸光?#21462;?#26681;据标准曲线和使用的样品体积计算出样品的蛋白浓?#21462;?/li>
    2、凝胶电泳

    (1)制胶器安装

    • 根据使用?#24471;?#20070;安装。

    (2)分离胶制备

    • 根据不同蛋白大小,选择不同浓度的分离胶(见附件表)。将制备好的胶溶液注入预先安装好的制胶器中,加入异丙醇封胶。室温水平放置30min左右。注意防止胶溶液产生气泡并注入制胶器中;注胶前再加入TEMED,防止注胶前凝固;注入异丙醇时需沿玻板一边缓慢拖动加入。

    (3)浓度胶制备

    • 分离?#32791;?#22266;后,沿玻板一边倒出异丙?#36857;?#24182;用滤纸吸干。再根据需要的体积制备浓度胶(见附表)。将制备好的胶溶液注入制胶器中,并把准备好的样品梳沿玻板一端缓慢插入胶溶液中,室温水平放置20-30min。注意样品梳与胶溶液之间避免气泡产生。

    (4)上样

    • 待浓缩?#32791;?#22266;好后,双手垂直拔出样品梳,并用Tris-Glycine SDS Running Buffer注入到内外槽中,形成闭合回路。用移液器吸取样品垂直梳孔上样,蛋白含量25ug/孔。注意内槽Tris-Glycine SDS Running Buffer需注满,外槽Tris-Glycine SDS Running Buffer没过底部3~5cm?#32431;傘?/li>

    (5)电泳

    • 上样完以后,连通电泳仪电源,注意正负极需连接正确,设定适宜的电泳参数,浓缩胶电泳参数为恒压80V,待样本进入分离胶时,可将电泳调至120V。?#21464;?#37210;蓝电泳到凝胶底部时,停止电泳,关闭电泳仪电源。
    3、转膜

    (1)准备工作

    • a. 转膜缓冲液至少提前2h (即开始电泳后)放入-20℃冰箱预冷。
    • b. 根据胶体大小选择,将Filter Paper及Nitrocellulose membrane剪裁至合适尺寸。
    • c. 目的蛋白>20KD选择0.45μm NC膜;目的蛋白<20KD选择0.2μm的NC膜或0.22μm的PVDF膜,选择完毕后将NC膜放在Western Transfer Buffer中浸泡备用,注意如使用的是PVDF膜需先放入?#29366;?#20013;浸泡5-10min,再放入Western Transfer Buffer中浸泡备用。

    (2)转膜

    • 取出玻板中的凝胶,在夹板上依次放一块多孔垫、三张滤纸、凝胶、NC膜、三张滤纸、一块多孔垫(“三明治”结构),将转好的膜放在转膜槽,按一定的条件进行转膜。(见附表)
    4、封闭
    • 将膜从“三明治”结构中取出,放入合?#23454;?#25239;体孵育槽中,加入Western Blocking Buffer室温孵育1h,一张6.3×8.3cm大小的膜加入6~7ml?#32431;傘?/li>
    5、一抗孵育
    • a. 将一抗用Western Antibody Dilution Buffer按照合适比例进行稀释。
    • b. 封闭结束后,将稀释好的一抗工作液倒入孵育槽中,室温2h或4℃过夜。
    6、洗涤
    • 一抗孵育结束后,加入TBST Buffer洗涤4次,5min/次。
    7、二抗孵育
    • a. 一抗洗涤结束前10min,将二抗用Western Antibody Dilution Buffer按照合适比例进行稀释。
    • b. 洗涤结束后,将稀释好的二抗工作液加入孵育槽中,室温1h。
    8、洗涤
    • 二抗孵育结束后,加入TBST Buffer洗涤4次,5min/次。
    9、曝光
    • a. 根据膜的大小,按每 10cm2 膜使用 1-2ml 工作液,按比例吸取等体积的 SolutionⅠ和 SolutionⅡ混匀,配制成发光检测工作液。
    • b. 用平头镊子将膜取出,膜的下?#30331;?#36731;接触吸水纸,去除膜上多余的液体。用移液器将工作液加到转印膜上,使其均有?#21754;牽?#23460;温孵育 1-2min,此步骤可在洁净保鲜膜上或塑料盒中完成。
    • c. 压片检测:将膜固定于片?#24515;凇?#26263;室内压片 1 分钟,立即显影定影,根据结果再调整压片时间。或直接分别压片 30 秒、1、3、 5 分钟,?#32531;?#19968;起显影定影观察结果。
    • d. 荧光成像仪检测:将膜放置?#25509;?#20809;成像仪内,参考仪器?#24471;?#20070;进行检测。

    附表1:BSA标准品稀释

    1mg/ml BSA(μl)稀释液(μl)对应的蛋白含量(mg/ml)
    0200
    1190.05
    2180.1
    4160.2
    8120.4
    1280.6
    1640.8
    2001

    附表2:分离?#21495;?#24230;的选择

    分子量(kDa)分离?#21495;?#24230;
    X≤1015%
    10<X≤1513.5%
    15<X≤2512%
    25<X≤3511%
    35<X≤4010%
    40<X≤559%
    55<X≤708%
    70<X≤1007%
    100<X6%
    备注:X为目的蛋白大小

    附表3:分离?#21495;?#21046;

    分离?#21495;?#24230;6%7%8%9%10%11%12%13.5%15%
    去离子水(mL)5.34.94.64.34.03.653.32.82.3
    30%丙烯酰胺 (mL)22.42.73.03.33.654.04.55.0
    1.5M Tris-HCL(pH8.8) (mL)2.5
    10%SDS(mL)0.1
    10%AP(mL)0.1
    TEMED(mL)0.01
    总体积(mL)10

    附表4?#21495;?#32553;?#21495;?#21046;

    5%浓缩胶5%浓缩胶5%浓缩胶5%浓缩胶5%浓缩胶
    去离子水(mL)1.12.12.73.44.1
    30%丙烯酰胺 (mL)0.330.50.670.831.0
    1.0M Tris-HCL(pH6.8) (mL)0.250.380.50.630.75
    10%SDS(mL)0.020.030.040.050.06
    10%AP(mL)0.020.030.040.050.06
    TEMED(mL)0.0020.0030.0040.0050.006
    总体积(mL)23456

    附表5:转膜条件选择

    分子量(kDa)分离?#21495;?#24230;
    X≤10恒流200mA,30min
    10 < X≤15恒流200mA,40min
    15< X≤20恒流200mA,50min
    20< X≤50恒流200mA, 1kDa/min+20min
    50< X≤100恒流200mA, 1kDa/min+30min
    100< X≤150恒流250mA, 1kDa/min+20min
    150< X≤180恒流270mA, 1kDa/min(时间控制在3h内)
    180< X恒流270mA, 1kDa/min(时间控制在4h内)
    备注:X为目的蛋白大小
  • IHC   1:200 - 1:500  [ 实验步骤 ]

    免疫组织化学标准操作流程(石蜡切片——非磷酸化项目检测)

    一、实验仪器及试剂

    1、实验器材

    微波炉、4℃冰箱、恒温恒湿箱、烘箱、光学显微镜、移液器、孵育湿盒、抗原修复盒。

    2、实验试剂
    • (1) 缓冲液:0.01M pH7.2 PBS ;0.01M pH7.2 PBST;
      试剂名称1*PBS/L试剂名称1*PBST/L
      NaH2PO40.23g1*PBS溶液1L
      Na2HPO41.15gTween 20 溶液0.001L
      NaCl8.5g用稀HCl溶?#27721;蚇aOH溶液调pH值
    • (2) 修复液(可选):0.01M pH7.2 PBS修复液;0.01M pH9.0 Tris-EDTA修复液;0.01M pH6.0 柠檬酸修复液;
    • (3) 封闭液:5%空白山羊血清;
    • (4) 3%过氧化氢(需新鲜配制,30% H2O2与dH2O体积比1:9);
    • (5) EnVision Systems检测体系, HRP显色系统: HRP RABBIT/MOUSE及配套DAB显色液;
    • (6) 脱蜡液、无水乙?#36857;?#20998;析纯)、去离子水(dH2O)、Mayer’s苏木素、中性树胶封片剂。

    二、实验步骤

    1.水化/脱蜡:
    • (1)烤片:将石蜡切片按同一朝向放置在切片架上,将其放入55℃的恒温箱中烤片30分钟;同时将脱蜡液1缸一起放入55℃的恒温箱中;
    • (2)脱蜡至水:将石蜡切片连同切片架一起放入脱蜡液1缸中,再一起从恒温箱中取出置于常温,5分钟后,将切片取出浸入到常温脱蜡液2缸中,并按照脱蜡液2、脱蜡液3、无水乙醇1、无水乙醇2、无水乙醇3的顺序依次将石蜡切片放入缸中,每缸5分钟;用流水清洗切片5分?#21360;?/li>
    注意:流水清洗时水流不能直接对着切片;操作过程中需一直保持切片处于湿润状态。
    2.灭活:
    • 将切片完全浸入到3%双氧水溶液中,室温,孵育10分钟;完成后流水清洗5分?#21360;?/li>
    注意:内源性酶含量高的组织,可以延长灭活时间至15-20分钟;双氧水需新鲜配制,可提前5-10分?#20248;?#21046;3%的双氧水。
    3.抗原修复:
    • 将切片浸入盛有修复液(一般情况下用0.01M pH7.2 PBS修复液)的修复盒中,将抗原修复盒?#20999;备?#22312;修复盒上;整体放入微波炉中,高火加热3分钟后停火,微波炉内静置5分钟;再高火加热3分钟后停火,微波炉内静置5分钟;随后中?#31361;?#21152;热1分钟后停火,微波炉内静置5分钟,?#32531;?#23558;切片连同抗原修复?#24515;?#20986;缓慢冷却至室?#38534;?/li>
    注意:修复?#30418;?#23436;全浸没切片上组织;修复过程中严禁打开微波炉门;修复完成后不可快速冷却;修复液可根据实验需求自行换用0.01M pH9.0 Tris-EDTA修复液或0.01M pH6.0 柠檬酸修复液。
    4.染色:
    • (1)封闭:待修复液温度降至室温后,?#26377;?#22797;盒中取出切片;用缓冲液PBS清洗切片2次,每次3分钟;去除切片?#31995;?#32531;冲液;在组织切片?#31995;?#21152;5%空白山羊血清封闭液;将切片水平放置在底部呈有水的孵育湿盒中,于37℃恒温孵育30分钟;
    • (2)一抗孵育:去除封闭液,在组织切片?#31995;?#21152;用缓冲液PBS稀释的一抗,水平放置于孵育湿盒中,于4℃孵育过夜;
    • (3)?#27425;攏?#23558;孵育湿盒取出室温?#27425;?5-30分钟,去除抗体工作液,用缓冲液PBST洗涤1次,5分钟;用缓冲液PBS洗涤3次,每次5分钟;
    • (4)二抗孵育:在组织切片?#31995;?#21152;二抗工作?#27721;?#27700;平放置于孵育湿盒中,于37℃恒温孵育1h;
    • (5)去除切片?#31995;?#28342;液,用缓冲液PBST洗涤1次,5分钟;用缓冲液PBS洗涤3次,每次5分钟;
    • (6)显色?#21512;?#33394;前5分钟,配置DAB显色工作液,C液:B液体积比1:100,充分混匀;在组织切片?#31995;?#21152;显色工作液,显微镜下密切观察颜色变化情况,通常10-60秒?#32431;?#24471;到合?#23454;?#26579;色强度;将切片浸入大量dH2O中?#32431;?#32456;止显色;
    • (7)复染、返蓝:将切片浸入Mayer’s苏木素中复染切片,用流水清洗10分?#21360;?/li>
    注意:染色过程中需一直保持切片处于湿润状态;染色过程中所有试剂使用过程中均需保证完全?#21754;?#20999;片上组织。
    5.脱水、封片:
    • (1)脱水:将清洗后的切片于无水乙醇中浸泡1次,10秒;高温(55℃-60℃)下完全干燥;
    • (2)封片:在切片中心滴加适量中性树胶,并加盖盖玻片。
  • IF   1:500 - 1:1000  [ 实验步骤 ]
    • 细胞样本

      免疫荧光实验操作流程(细胞样本)

      一、实验仪器及试剂

      1、实验器材

      4℃冰箱、恒温恒湿箱、通风橱、移液器、避光孵育湿盒。

      2、实验试剂
      • (1) 缓冲液:0.01M pH7.2 TBS ;0.01M pH7.2 TBST
        试剂名称1*TBS/L试剂名称1*TBST/L
        Tris1.21g1*TBS1L
        NaCl8.8gTween 20 溶液0.001L
        用稀HCl溶?#27721;蚇aOH溶液调pH值用稀HCl溶?#27721;蚇aOH溶液调pH值
      • (2) 固定液:4%中性甲醛固定液(TBS缓冲液配制)
      • (3) 封闭液:5%空白山羊血清
      • (4) 通透剂:0.3% Triton X-100(TBS缓冲液配制)
      • (5) 二抗:
        Alexa Fluor 594-conjugated AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)# AS074;
        Alexa Fluor 488-conjugated AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)# AS073;
        Alexa Fluor 594-conjugated AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L)# AS077;
        Alexa Fluor 488-conjugated AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L)# AS076;
      • (6) 染核试剂:1mg/mL DAPI(用时使用dH2O配制)
      • (7) 去离子水(dH2O)、抗荧光衰减封片剂。

      二、实验步骤

      1.样本?#25353;?#29702;
      • (1) 弃去培养基,在细胞上缓慢加入常温TBS,清洗2次,每次5秒;
      • (2) 细胞固定:在细胞?#32454;哺?4%中性甲醛固定液(TBS缓冲液配制),置于4℃,固定15min;固定?#30418;?#36275;量;
      • (3) 固定液的清洗:去除固定液,使用4℃预冷的TBS缓冲液,漂洗3次,每次5分钟;
      • (4) 通透(可选):加入TBS缓冲液配制的0.3% Triton X-100室温孵育10min,TBS漂洗3次,每次5分钟(膜蛋白可省略细胞通透步骤);
      注意?#30418;?#36991;免实验操作时温差过大或温度骤变;固定?#30418;?#20445;证足量,可过量使用;甲醛有毒性,加固定?#27721;?#22266;定后的清洗需在通风橱内操作。
      2.染色步骤
      • (1)封闭:用5%空白山羊血清将样本完全?#21754;牽?#20999;片需放置于湿?#24515;冢?#32454;胞?#35013;?#21487;直接将?#35013;?#23494;封好,置于37℃恒温恒湿培养箱孵育30min;
      • (2)一抗孵育:去除封闭液,直接在样本?#31995;?#21152;TBS缓冲液配制的一抗工作液,样本需完全?#21754;牽?#20999;片需放置于湿?#24515;冢?#32454;胞?#35013;?#21487;直接将?#35013;?#23494;封好,置于4℃孵育过夜;
      • (3)?#27425;攏?#23558;样本置于常温,?#27425;?5min,去除抗体工作液,用缓冲液TBST洗涤1次,5分钟;用缓冲液TBS洗涤3次,每次5分钟;
      • (4)二抗孵育:在样本?#31995;?#21152;与一抗种属对应的荧光二抗工作液,样本需完全?#21754;牽?#36991;光,37℃,孵育1小时;去除二抗工作液,用缓冲液TBST洗涤1次,5分钟;用缓冲液TBS洗涤3次,每次5分钟;
      • (5)染核:在样本?#31995;?#21152;DAPI工作液,使用dH2O配制,DAPI溶液:dH2O体积比1:500,避光,室温,孵育10分钟;去除DAPI工作液,用缓冲液TBST洗涤1次,5分钟;用缓冲液TBS洗涤3次,每次5分钟;
      • (6)细胞?#35013;?#21487;直接加入抗荧光衰减封片剂后,于荧光显微镜下观察并采集图像;细胞?#31185;?#28404;加抗荧光衰减封片剂,?#32531;?#21152;盖盖玻片封片,再于荧光显微镜下观察并采集图像;细胞爬片可取出,盖在滴加抗荧光衰减封片剂的载玻片上后,于荧光显微镜下观察并采集图像。
      注意:实验中,所有试剂滴加应准确、快速、足量,不能出现干片的情况;染色步骤从二抗孵育开?#36857;?#21518;续所有步骤都需注意避光操作;染色完成后需及时观察并采集图像,避免干燥和荧光物质淬灭。
    • 组织样本

      免疫荧光实验操作流程(石蜡切片)

      一、实验仪器及试剂

      1、实验器材

      微波炉、4℃冰箱、恒温恒湿箱、烘箱、移液器、避光孵育湿盒、抗原修复盒。

      2、实验试剂
      • (1) 缓冲液:0.01M pH7.2 TBS ;0.01M pH7.2 TBST
        试剂名称1*TBS/L试剂名称1*TBST/L
        Tris1.21g1*TBS1L
        NaCl8.8gTween 20 溶液0.001L
        用稀HCl溶?#27721;蚇aOH溶液调pH值用稀HCl溶?#27721;蚇aOH溶液调pH值
      • (2) 修复液(可选):0.01M pH9.0 Tris-EDTA修复液;0.01M pH6.0 柠檬酸修复液
      • (3) 封闭液:5%空白山羊血清
      • (4) 二抗:
        Alexa Fluor 594-conjugated AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)# AS074;
        Alexa Fluor 488-conjugated AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)# AS073;
        Alexa Fluor 594-conjugated AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L)# AS077;
        Alexa Fluor 488-conjugated AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L)# AS076;
      • (5) 染核试剂:1mg/mL DAPI(用时使用dH2O配制)
      • (6) 去离子水(dH2O)、抗荧光衰减封片剂。

      二、实验步骤

      1.水化/脱蜡:
      • (1) 烤片:将石蜡切片按同一朝向放置在切片架上,将其放入55℃的恒温箱中烤片30分钟;同时将脱蜡液1缸一起放入55℃的恒温箱中;
      • (2) 脱蜡至水:将石蜡切片连同切片架一起放入脱蜡液1缸中,再一起从恒温箱中取出置于常温,5分钟后,将切片取出浸入到常温脱蜡液2缸中,并按照脱蜡液2、脱蜡液3、无水乙醇1、无水乙醇2、无水乙醇3的顺序依次将石蜡切片放入缸中,每缸5分钟;用流水清洗切片5分?#21360;?/li>
      注意:流水清洗时水流不能直接对着切片;操作过程中需一直保持切片处于湿润状态。
      2.抗原修复:
      • 将切片浸入盛有修复液(一般情况下用0.01M pH9.0 Tris-EDTA修复液)的修复盒中,将抗原修复盒?#20999;备?#22312;修复盒上;整体放入微波炉中,高火加热3分钟后停火,微波炉内静置5分钟;再高火加热3分钟后停火,微波炉内静置5分钟;随后中?#31361;?#21152;热1分钟后停火,微波炉内静置5分钟,?#32531;?#23558;切片连同抗原修复?#24515;?#20986;缓慢冷却至室?#38534;?/li>
      注意:修复?#30418;?#23436;全浸没切片上组织;修复过程中严禁打开微波炉门;修复完成后不可快速冷却;修复液可根据实验需求自行换用0.01M pH6.0 柠檬酸修复液。
      3.染色:
      • (1)封闭:用5%空白山羊血清将样本完全?#21754;牽?#20999;片需放置于湿?#24515;冢?#32622;于37℃恒温恒湿培养箱孵育30min;
      • (2)一抗孵育:去除封闭液,直接在样本?#31995;?#21152;TBS缓冲液配制的一抗工作液,样本需完全?#21754;牽?#20999;片需放置于湿?#24515;冢?#32622;于4℃孵育过夜;
      • (3)?#27425;攏?#23558;样本置于常温,?#27425;?5min,去除抗体工作液,用缓冲液TBST洗涤1次,5分钟;用缓冲液TBS洗涤3次,每次5分钟;
      • (4)二抗孵育:在样本?#31995;?#21152;与一抗种属对应的荧光二抗工作液,样本需完全?#21754;牽?#36991;光,37℃,孵育1小时;去除二抗工作液,用缓冲液TBST洗涤1次,5分钟;用缓冲液TBS洗涤3次,每次5分钟;
      • (5)染核:在样本?#31995;?#21152;DAPI工作液,使用dH2O配制,DAPI溶液:dH2O体积比1:500,避光,室温,孵育10分钟;去除DAPI工作液,用缓冲液TBST洗涤1次,5分钟;用缓冲液TBS洗涤3次,每次5分钟;
      • (6)滴加抗荧光衰减封片剂,?#32531;?#21152;盖盖玻片封片,再于荧光显微镜下观察并采集图像。
      注意:实验中,所有试剂滴加应准确、快速、足量,不能出现干片的情况;染色步骤从二抗孵育开?#36857;?#21518;续所有步骤都需注意避光操作;染色完成后需及时观察并采集图像,避免干燥和荧光物质淬灭。
  • IP   1:200 - 1:500  [ 实验步骤 ]

    IP检测

    一、实验试剂

    • (1)rProtein A/G Plus MagPoly Beads(RM09008)
    • (2)裂解液&洗杂液:Cell lysis buffer for IP (without inhibitors)(RM00022)
    • (3)蛋白酶抑制剂
    • (4)封闭液?#27721;?3% BSA 的 1X PBS
    • (5)1×PBS 缓冲液(RM00012)
    • (6)5×loding buffer(RM00001)(使用时用去离子水稀释至工作浓度?#32431;桑?/li>
    • (7)Control IgG (AC005/ AC011/AC034)

    二、实验步骤

    1、样本处理

    (1)贴壁培养细胞

    • a. 取裂解液室温溶解混匀,根据需要选择添加或不添加蛋白酶抑制剂。
    • b. 去除贴壁细胞的培养液,用PBS、NS或无血清培养基清洗1次,低速离心,弃上清,留取沉淀。
    • c. 按照6?#35013;?#27599;孔加入100~200μl裂解液的比例,加入裂解液。移液器轻轻?#33633;潁?#20351;裂解?#27721;?#32454;胞充分接触。通常裂解液作用于细胞1~5s内,细胞会被裂解。
    • d. 1000~12000g,离心3~5min(如果用冷冻离心机4℃效果更佳),取上清。

    (2)悬浮培养细胞

    • a. 取裂解液室温溶解混匀,根据需要选择添加或不添加蛋白酶抑制剂。
    • b. 速离心悬浮细胞,弃上清,收集沉淀。
    • c. ?#31181;?#36731;弹细胞,使其松散。按照6?#35013;?#27599;孔加入100~200μl裂解液的比例,加入NP-40裂解液。通常6?#35013;?#27599;孔加入100~200μl裂解液已经足够,但如果细胞密度非常高可以?#23454;?#21152;大裂解液的用量150~200μl,再用?#31181;?#36731;弹以充分裂解细胞。充分裂解后应无明显沉淀。
    • d. 1000~12000g,离心3~5min(如果用冷冻离心机4℃效果更佳),取上清。

    (3)组织样本

    • a. 取裂解液室温溶解混匀,根据需要选择添加或不添加蛋白酶抑制剂。
    • b. 把组织剪切成细小的碎片,越小?#33014;謾?/li>
    • c. 取液氮或超低温冰箱中冷冻30min以?#31995;?#32452;织,?#26438;?#29992;液氮研磨,研磨过程尽量控制在1~2min之内,以减少蛋白的降解。
    • d. 按照每20mg组织加入100~200μl裂解液的比例,加入含有PMSF的裂解液。冰上或4℃裂解30-60min。(步骤3、4也可采用以下过程:按照每20mg组织加入100~200μl裂解液的比例加入NP-40裂解液。用玻璃匀浆器或组织研磨器匀浆,直至充分裂解,过程尽量控制在1~2min之内,以减少蛋白的降解。)
    • e. 按照每20mg组织加入100~200μl裂解液的比例,加入裂解液。
    • f. 1000~12000g,4℃离心10~15min(如无低温离心机,室温下离心也可),取上清。
    2、磁珠预处理
    • (1)将rProtein A/G Plus MaqPoly Beads颠倒或漩涡混匀,翻转?#21487;?#21457;现底部无黑色沉淀?#32431;傘?/li>
    • (2)取30μl rProtein A/G Plus MaqPoly Beads?#21015;?#30340;EP管中,放在磁分离器上,待溶液澄清后,用移液器吸弃保护液。
    • (3)将EP管从磁分离器上取下来,加入1ml Cell lysis buffer for IP (without inhibitors),混匀,放置在磁分离器上,收集磁珠,用移液器吸弃洗杂液,重复2次。
    • (4)将EP管从磁分离器上取下来,加入1mL的3% BSA,置于翻转混合仪4℃封闭1h.
    • (5)重复步骤3),备用。
    3、磁珠、抗原-抗体复合物结合
    • (1)将含有抗原的样品(通常300μl-1000μl,抗原量200μg)中加入目标抗体(通常3μg),置于翻转混合仪4℃?#36335;从?h或过夜。
    • (2)将上述完成抗体-抗原结合的复合物与备用好的磁珠进行混合,置于4℃?#36335;从?h或过夜。
    • (3)将上述磁珠-抗体-抗原复合物放在磁分离器上进行分离,收集上清液,以备后续检测。
    • (4)向离心管中加入1ml洗杂液,用移液器轻轻?#33633;?#20351;磁珠-抗体-抗原复合物均匀分散,?#32531;?#36827;行磁性分离,弃上清液;从磁分离器上取下离心管,重复洗涤两次。
    4、抗原洗脱

    (1)变性洗脱(此方法洗脱的样品适用于SDS-PAGE检测。)

    • a. 从磁分离器上取下离心管,向其中加入30μl 2X SDS-PAGE Loading Buffer混合均匀,95℃加热15min。
    • b. 置于磁性分离器上进行磁性分离,收集上清液进行SDS-PAGE检测。

    (2)非变性洗脱

    • a. 向磁珠-抗体-抗原复合物中加入50μl洗脱液,混合均匀,室温孵育5min。
    • b. 置于磁性分离器上进行磁性分离,收集洗脱液?#21015;?#30340;EP管中。
    • c. 重复步骤1)和2),收集洗脱液,与2)中洗脱液混合,加入中和液中和至pH7.0-8.0。用于后期功能分析。
  • ChIP   1:20 - 1:50  [ 实验步骤 ]

    ChIP标准操作流程

    一、实验试剂

    • (1)PBS缓冲液(RM00012)
    • (2)TE 缓冲液
    • (3)甲醛:40%
    • (4)甘氨酸:20%
    • (5)Lysis Buffer
    • (6)Dilution buffer
    • (7)Wash buffer I
    • (8)Wash buffer II
    • (9)Wash buffer III
    • (10)Elution buffer
    • (11)rProtein A/G Plus MagPoly Beads(RM09008)

    二、实验步骤

    1、细胞裂解
    • (1)取1x107细胞,加入1ml PBS和25ul甲醛(40%)混匀后,于冰上放置10min(混匀2-3次)。
    • (2)加入50ul甘氨酸(20%),混匀后静置5min。
    • (3)3000rpm离心5min,用1ml PBS清洗2遍。
    • (4)加入200ul Lysis Buffer(含10ul蛋白酶抑制剂),置于旋转摇床4℃裂解30min。
    • (5)加入800ul Dilution buffer,混匀后超声15-20min。
    • (6)12000rpm离心10min取上清,吸取少量裂解液DNA回收检测。
    • (7)琼脂糖电泳检测DNA打断程度,DNA长度应在150-900 bp之间。
    • (8)使用Qubit?荧光定量仪检测染色质浓?#21462;?/li>
    注意:整个过程在低温下进行,超声条件根据检测结果进行调整。
    2、IP(免疫沉淀:磁珠法):
    • (1)取60ul 磁珠加入1ml BSA(1mg/ml,TE缓冲液配制),于旋转摇床4℃旋转5min,至于磁力架弃去液体,加入1ml BSA重复此操作1次。
    • (2)加入1ml TE溶液清洗磁珠两次,于4℃放置备用。
    • (3)取180ul染色质裂解液,加入320ul Dilution buffer(一份IP样品), 分别加入5ul抗体,1ul Normal Rabbit IgG,5ul Histone H3于4℃过夜,?#32531;?#21152;入60ul处理好的磁珠,4℃孵育2h。
    • (4)依?#38382;?#29992;Wash buffer I/II/III 洗涤磁珠,完成后使用TE溶?#21512;?#28068;两次。
    • (5)弃去上清后加入200ul Elution buffer,置于旋转摇床室温旋转10min。
    • (6)吸取上清加入10ul蛋白酶K,65℃水浴至少4h。
    • (7)使用DNA回收试剂盒回收DNA。
    注意?#22909;?#20221;IP样本应含DNA的量为7-10ug DNA(转录因子15-20ug),抗体加入量为3-5ug,可根据实验进行优化。
    3、Q-PCR:

    (1)?#20174;?#20307;系 (20ul)

    DNA模板:5 μl
    引物:5 μl
    Green Master Mix:10 μl

    (2)?#20174;?#20307;系 (20ul)

    Stage 1预变性Reps: 195 ℃5 min
    Stage 2循环?#20174;?bReps: 4095 ℃10 sec
    60 ℃30 sec
    Stage 3融解曲线Reps: 195 ℃15 sec
    60 ℃60 sec
    95 ℃15 sec
    4、结果计算

    假设 Input 起始浓度为 a,Ct1 个循环数扩增后达到阈值;IgG 起始浓度为 b,Ct2 个循环数扩增后达到阈值;目的蛋白起始浓度为 c,Ct3 个循环数扩增后达到阈值。则可以得到如下公式:

    a×2Ct1 = b×2Ct2 = c×2Ct3
    b/a = 2Ct1/2Ct2 = 2(Ct1-Ct2) b:a=2(Ct1-Ct2)
    c/a = 2Ct1/2Ct3 = 2(Ct1-Ct3) c:a=2(Ct1-Ct3)
    检测结果=2(Ct1-Ct3)/2(Ct1-Ct2)
  • ChIPseq   1:20 - 1:50

理论分子量11kDa
实际分子量11kDa
存储缓冲液Store at -20℃. Avoid freeze / thaw cycles.
Buffer: PBS with 0.02% sodium azide,50% glycerol,pH7.3.
实验方法Western blotting    Immunohistochemistry    Immunofluorescence    Immunoprecipitation    
阳性样本293T
细胞定位Chromosome,Nucleus
纯化方式Affinity purification

Acetyl-Histone H4-K8 pAb 检测图片

ABclonal:Western blot - Acetyl-Histone H4-K8 pAb (A7258) }

Western blot - Acetyl-Histone H4-K8 pAb (A7258)

Western blot analysis of extracts of various cell lines, using Acetyl-Histone H4-K8 antibody (A7258) at 1:1000 dilution.
Secondary antibody: HRP Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) (AS014) at 1:10000 dilution.
Lysates/proteins: 25ug per lane.
Blocking buffer: 3% nonfat dry milk in TBST.
Detection: ECL Enhanced Kit (RM00021).
Exposure time: 90s.
ABclonal:Immunohistochemistry - Acetyl-Histone H4-K8 pAb (A7258) }

Immunohistochemistry - Acetyl-Histone H4-K8 pAb (A7258)

Immunohistochemistry of paraffin-embedded rat ovary using H4K8ac antibody (A7258) at dilution of 1:100 (40x lens).
ABclonal:Immunohistochemistry - Acetyl-Histone H4-K8 pAb (A7258) }

Immunohistochemistry - Acetyl-Histone H4-K8 pAb (A7258)

Immunohistochemistry of paraffin-embedded human breast using H4K8ac antibody (A7258) at dilution of 1:100 (40x lens).
ABclonal:Immunohistochemistry - Acetyl-Histone H4-K8 pAb (A7258) }

Immunohistochemistry - Acetyl-Histone H4-K8 pAb (A7258)

Immunohistochemistry of paraffin-embedded human gastric cancer using H4K8ac antibody (A7258) at dilution of 1:100 (40x lens).
ABclonal:Immunohistochemistry - Acetyl-Histone H4-K8 pAb (A7258) }

Immunohistochemistry - Acetyl-Histone H4-K8 pAb (A7258)

Immunohistochemistry of paraffin-embedded mouse brain using H4K8ac antibody (A7258) at dilution of 1:100 (40x lens).
ABclonal:Immunofluorescence - Acetyl-Histone H4-K8 pAb (A7258) }

Immunofluorescence - Acetyl-Histone H4-K8 pAb (A7258)

Immunofluorescence analysis of HeLa cells using Acetyl-Histone H4-K8 antibody (A7258). Blue: DAPI for nuclear staining.
ABclonal:Chromatin Immunoprecipitation - Acetyl-Histone H4-K8 pAb (A7258) }

Chromatin Immunoprecipitation - Acetyl-Histone H4-K8 pAb (A7258)

Chromatin immunoprecipitation analysis of extracts of 293 cell line, using H4K8ac antibody (A7258) and rabbit IgG. The amount of immunoprecipitated DNA was checked by quantitative PCR. Histogram was constructed by the ratios of the immunoprecipitated DNA to the input.

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